Клеточные технологии: еще ближе к клинике
Чипы, митохондрии и не только
Первое слово было предоставлено директору Центра конструирования хромосом Университета Тоттори (Япония) Митсуо Ошимура. Он много лет занимается генной и клеточной терапией различных заболеваний с использованием технологии искусственных хромосом человека и индуцированных стволовых плюрипотентных клеток. В своих экспериментальных работах ученый обнаружил, что векторы генной терапии, такие как вирусы, плазмиды, бактериальные искусственные хромосомы и дрожжевые искусственные хромосомы характеризуются возможностью постепенного снижения и исчезновения экспрессии. Искусственные хромосомы человека лишены многих недостатков, в том числе и этих, поскольку созданы они методами хромосомной инженерии в определенных клетках. Работы японского ученого показали, что искусственные хромосомы человека могут быть использованы в сочетании с генно-клеточными технологиями для терапии различных заболеваний.
Большим спектром исследований занимается во Франции (Марсель) профессор Патрис Буржуа. Его научные интересы широки: растительные биотехнологии, генетика человека, клинические исследования… В настоящее время он вплотную подошел к двум проектам – созданию микрочипа для быстрой диагностики нервно-мышечных заболеваний и исследованию прогерии (болезни преждевременного старения). В центр проекта по созданию микрочипов, который был организован Французской ассоциацией по лечению миопатий и несколькими европейскими диагностическими лабораториями, Буржуа и другие ученые поставили разработку, развитие и проверку нового высокочувствительного диагностического набора с высокой производительностью для эффективной диагностики нервно-мышечных заболеваний.
– Всё разработанное нами оборудование предназначено как для оценки известных генов, которые предположительно одномоментно участвуют в возникновении нервно-мышечных заболеваний, так и для эффективного анализа данных через оптимизированные биоинформатические приборы в промежутке от 72 часов до одной недели, – отметил в своем сообщении П.Буржуа. – Помимо развития новых диагностических молекулярных приборов, наш микрочип также способствует накоплению знаний о нервно-мышечной патологии путем значительного сокращения времени на открытие новых заболеваний, вызванных мутациями при использовании подходящих для каждого данного случая генов.
Не первый год приезжает в столицу на подобные симпозиумы наш соотечественник Шухрат Миталипов, который занимается репродукцией в исследовательском центре Орегонского университета здоровья и исследований США. Он рассказал о своих последних работах, связанных с исследованиями митохондриального генома и его значении для развития организма. Митохондрии – это клеточные органеллы, отвечающие за выработку основной энергии для клеток. Митохондрии содержат также свои собственные гены, и мутации в митохондриальной ДНК являются причиной многих наследственных и приобретенных заболеваний. Среди них – рак, деменция, сахарный диабет, а также тяжелые пороки и поражения сердца, мозга, мышц и печени. Поскольку ДНК митохондрий наследуются только по материнской линии, через яйцеклетку, то эти болезни передаются в основном от матери к детям.
В лаборатории Миталипова разработана технология, позволяющая заменить дефектную митохондриальную ДНК в яйцеклетках обезьян здоровыми донорскими митохондриями, взятыми от других обезьян. В результате на свет появились несколько малышей, которые унаследовали ядерные гены от матери, но ДНК была получена от других доноров. Ранее подобные эксперименты на животных не были успешными, и считалось, что подобная корректировка генов в яйцеклетках невозможна.
– Мы надеемся, – сказал Ш.Миталипов, – что уже в ближайшем будущем наша технология позволит полностью искоренить целый класс наследственных заболеваний, передающихся через митохондриальные гены, путем их корректировки в яйцеклетках еще до зачатия ребенка.
Между плюсами и минусами
Профессор Борис Афанасьев из Института детской гематологии и трансплантологии им. Р.М.Горбачёвой (С.-Петербург) поделился опытом лечения наследственных заболеваний с помощью трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Он обозначил наследственные генные болезни как большую группу заболеваний. Они характеризуются различным типом наследования, возрастом манифестации (от младенческого до взрослого), прогрессирующим течением и, вследствие этого, широким спектром клинических проявлений. Частота большинства наследственных болезней низкая, однако суммарно эти состояния весьма заметны в популяции. В среднем частота заболеваний составляет примерно 1 : 10-12 тыс. новорожденных.
Как отметил Афанасьев, за последние 20 лет в терапии наследственных заболеваний сделаны значительные успехи. Это связано с заместительной терапией, энзимотерапией, генно-инженерными методами, аллогенной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК). Но у заместительной терапии есть недостатки: необходимость пожизненного назначения, возникновение аллергических реакций, выработка антител к лекарственным препаратам.
– Должен подчеркнуть, что одним из наиболее эффективных методов лечения у детей ряда врожденных и наследственных заболеваний, протекающих с поражением кроветворной и иммунной систем, является алло-ТГСК, – сказал докладчик. – При этом более чем у 80% пациентов удается достичь полного излечения.
С 2005 по 2012 г. сотрудники Института им. Р.М.Горбачёвой выполнили 15 алло-ТГСК от неродственного донора у детей со следующими наследственными болезнями: синдром Костманна, синдром Вискотта – Олдрича, анемия Фанкони, болезнь Краббе и многими другими заболеваниями. По наблюдениям ученых, общая трехлетняя выживаемость пациентов составила 72%, при оценке эффективности алло-ТГСК отмечалась стабилизация, улучшение или полное излечение от заболевания. Среди основных осложнений были инфекции, реакция «трансплантат против хозяина», токсичность, связанная с режимом кондиционирования.
– Генная терапия – метод лечения, активно разрабатываемый для некоторых нозологических форм иммунодефицитных состояний, болезней накопления, синдромов врожденной костномозговой недостаточности, – заключает Б.Афанасьев. – К преимуществам такой терапии относятся отсутствие токсических осложнений, реакции «трансплантат против хозяина», которые развиваются после алло-ТГСК. Но неразрешенными вопросами при применении генной терапии являются риск развития острого лейкоза из-за инсерционного мутагенеза, недостаточный и нестойкий эффект, вероятность развития инфекционных осложнений, связанных с возможностью репликации вируса.
Клеткам с индуцированной плюрипотентностью как модели нейродегенеративных заболеваний было посвящено выступление профессора Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН Сергея Киселёва. Он сообщил, что технология получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из соматических клеток взрослого организма впервые была предложена в 2006 г. Такие клетки по многим своим свойствам сходны с самыми универсальными эмбриональными стволовыми клетками. Основными областями применения ИПСК являются регенеративная медицина и моделирование заболеваний человека. Особый интерес при моделировании различных патологий человека представляют нейродегенеративные заболевания: болезнь Паркинсона, хорея Хантингтона, макулярная дегенерация и ряд других.
Дифференцировка ИПСК в специализированный тип клеток представляет уникальную возможность для моделирования патологий в связи с тем, что во взрослом организме нейрональные клетки имеют ограниченную доступность, а животные или существующие клеточные модели не являются адекватными.
В исследовании, которое провели ученые института, был получен ряд ИПСК от пациентов, носителей болезни Паркинсона, Хантингтона, наследственной макулодистрофии с помощью лентивирусной модификации фибробластов кожи транскрипционными генами. Клеточные линии, вместе с плюрипотентностью, были полностью охарактеризованы специалистами. Для каждого типа патологии разработаны протоколы направленной дифференцировки ИПСК в специализированные нейрональные типы клеток.
Работу генно-модифицированных гемопоэтических стволовых клеток, направленных на лечение пациентов с ВИЧ-ассоциированными злокачественными заболеваниями, выбрал темой своего сообщения Аксель Цандер из Германии (Университетская клиника Гамбург – Эппендорф). Он отметил, что высокоактивная антиретровирусная терапия показала большую эффективность в подавлении репликации ВИЧ, однако данный вид лечения всё еще недоступен для большинства пациентов. Кроме того, такая терапия не приводит к ликвидации вируса и часто сопровождается тяжелыми побочными эффектами. Также появление новых штаммов вируса окажется ограничивающим фактором в лечении пациентов.
Трансплантация генетически защищенных гемопоэтических стволовых клеток может привести к полному подавлению вирусной репликации, – сказал Цандер. – Это убедительно показали исследования группы ученых, которые пересадили ВИЧ-положительным реципиентам с лейкозом гемопоэтические стволовые клетки от гомозиготного мутантного донора.
Недавно ученые немецкой клиники предложили новый принцип генной терапии на основе экспрессии мембран-связанного ингибитора в клетках ВИЧ после трансдукции ретро-вирусным вектором. Испытания в многочисленных доклинических исследованиях прошли успешно, получены первые данные при клинических испытаниях этой новейшей методики.
Высокие стандарты научной мысли
Так выразился о российских ученых, как и в целом о российской науке, профессор регенеративной медицины Каролинского университета (Швеция) Паоло Маккиарини, который хорошо знаком читателям «Медицинской газеты».
Он рассказал о выполнении трансплантаций аллогенной и биосинтетической трахеи, и о том, насколько это значимо для создания органов в будущем.
Персональные интересы профессора Маккиарини связаны с хирургией органов шеи и груди, а сам он считается одним из пионеров тканевой инженерии трахеи, обладает огромным опытом по трансплантации трахеи. В 2008 г. он впервые пересадил тканеинженерную трахею, изготовленную в биореакторе, с использованием собственных клеток пациентки. В следующем году трахея была сформирована внутри тела человека, и биореактор уже не применялся. К 2010 г. в Западной Европе было выполнено 9 подобных операций. В ноябре 2011 г. Маккиарини трансплантировал 36-летнему пациенту с диагнозом «рак трахеи», перенесшему радиотерапию, трахею, каркас которой был изготовлен из наноматериалов. Благодаря подобному оперативному вмешательству были сняты многие этические вопросы.
В конце 2010 г. , как уже писала «МГ», операция по трансплантации трахеи с использованием методов регенеративной медицины впервые была проведена в Российском научном центре хирургии им. Б.В.Петровского под руководством Паоло Маккиарини (в режиме on line). Эта операция открыла большие перспективы в лечении тяжелых заболеваний, связанных с утратой важнейших органов и тканей.
Недавно профессор возглавил созданный на базе Кубанского государственного медицинского университета и краевой клинической больницы № 1 им. С.В.Очаповского в Краснодаре первый в России исследовательский, образовательный и клинический центр регенеративной медицины, в котором проводятся исследования, посвященные регенерации дыхательных путей и легкого, и где проведена первая трансплантация трахеи, созданной на основе наноком-позитного каркаса с использованием собственных клеток пациента.
В рамках Международного симпозиума «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий» прошел сателлитный симпозиум, в котором с докладами выступили ученые Медико-генетического научного центра РАМН, Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова, Института репродуктивной генетики (США).
Татьяна КУЗИВ, корр. «МГ»